Ethanol precipitation

Ethanol precipitation是在wet lab裡頭常常用來將DNA從水中給precipitate下來的方法。

在做ethanol precipitation時很重要的一點是在溶液中必須加入cation，這樣才能順利的將DNA給precipitate下來。最近格主忽然發現有許多人並不道這點，或著是知道要加入cation，但卻不明白為什麼，也不知道到底ethanol為什麼可以precipitate DNA，只是照著實驗室學長姊的指導，把這個準則給背下來。

其實這個原理滿好懂的，只要有一點高中化學的基礎，就可以完全理解這件事。以下我就簡單的說明一下。

要知道DNA之所以會溶於水是因為它朝向外頭的backbone帶有負電，所以水分子會和它形成氫鍵，在DNA molecules的周圍形成類似hydrating shell的結構，於是DNA就會被這一堆圍繞著它的水分子給分隔開來，慢慢的均勻散佈在水中，這時，DNA就被水給”dissolve”了。

而如果我們能夠把這個負電給中和掉，很顯然水就無法和DNA形成氫鍵，自然也就無法dissolve DNA。同時，我們加進去的ethanol因為也可以和水形成氫鍵，於是我們可以用它來和DNA搶水，把水從DNA的周圍給”移走”，於是我們就能把DNA給precipitate下來。是以加入cation的目的就很明顯了-我們希望cation能夠和DNA形成ionic bonds，將DNA帶有的負電給neutralized掉。

但事情沒這麼簡單。想想看像NaCl這類的鹽類進入水中會發生什麼事?

很顯然它會dissolve在水裡變成Na⁺和Cl^-，而不會像平常那樣形成非常穩定的crystal。這是因為水有很高的dielectric constant，根據Coulomb’s law

[F = (Q₁ * Q₂)/(e * r²)，F是electrostatic force，e代表dielectric constant， Q₁和Q₂和代表兩個離子的電荷，r是兩個離子間的距離]

我們可以知道，當e很高的時候，F是很小的，所以兩個具有相反電荷的離子在這種情況底下並不會形成ionic bonds進而變成crystal，反而會被水分開，分別與水形成氫鍵。換個方式說，水會在它們外頭分別形成所謂的hydrating shell，將它們給隔開，讓他們均勻的溶在水中。

同樣的道理當然也適用於帶負電的DNA和我們加進去的cation。所以在沒有ethanol的情況底下，DNA和cation是不會形成ionic bonds的。

可是當ethanol被加進水中，dielectric constant比較低的ethanol會降低現在這個solution overall的dielectric constant，於是F就增加了，這個時候，DNA和cation才能形成ionic bonds，把電性neutralize掉，變成crystal被precipitate下來。

除此之外，cation還有其他的功用:它可以stabilize DNA的double helix結構。

第一眼看到這個說法似乎很怪，cation顯然會干擾DNA的鹼基對形成氫鍵，照這樣的邏輯去推論，cation應該是會”destabilize” DNA才對。

會有這個想法大概都是受到平常做實驗，特別是在設計primer或著做PCR時，計算GC content提到GC%的高低會影響DNA的melting temperature (T_m，指有一半的DNA molecules被denature成為單股時的溫度，最簡單的算法: T_m= [4(G+C)+2(A+T)]℃) ，於是留下了hydrogen bonds是影響DNA stability的主因的印象。

不過實際上兩股DNA的鹼基配對所形成的氫鍵對於DNA整體的stability幫助不大 (請注意，是幫助不大，不是沒有幫助。譬如說GC配對對於DNA stability的貢獻就比AT配對要來得大，因為GC可以形成三個hydrogen bonds，但AT只能形成兩個。當然GC能夠contribute to double helix的stability還有他的base stacking effect是比較被favored的) ，它們扮演的角色主要還是在使得DNA相互配對的鹼基具有specificity上。

鹼基對之間的hydrogen bonds之所以對DNA overall的stability影響不大是因為DNA是溶在「水中」的，那些在AT與GC鹼基之間形成的氫鍵，也可以和水分子形成hydrogen bonds，而且它們之間形成的hydrogen bonds並不會比它們以單股形式存在時和水分子形成的hydrogen bonds強，而這些鹼基間的氫鍵，必須比單股形式的DNA鹼基與水分子之間形成的氫鍵要強，它們才能stabilized DNA。

那到底是什麼原因導致DNA在水中會spontaneously形成double helix的結構?

答案很簡單，double helix結構的stability還是由free energy (△G) 的改變來決定。大家應該都知道△G與entropy和enthalpy有關:

[△G=△H-T△S，△H是enthalpy的改變量，△S是entropy的改變量，T則是絕對溫度，△G是負的時候，反應會傾向spontaneous發生]

在這裡，enthalpy只扮演微乎其微的角色，因為在dissolve DNA時被interfered的hydrogen bonds會被DNA backbone與水分子形成的hydrogen bonds給compensate，所以我們可以不考慮它的影響。

至於entropy，由於DNA的鹼基是比較hydrophobic的結構，所以當這些鹼基expose在水中，水分子會在它們的周圍排列成比較order的結構，這些水分子之間的interactions也比一般的水分子來得強，於是entropy就降低了，是以single strand的DNA在水中是比較不被favored的結構。

反之，當兩條DNA彼此纏繞形成double helix時，這些鹼基會被pack在中間，兩股DNA彼此complementary的base之間會形成氫鍵，此外，同一股上相鄰的鹼基彼此也會以Van Der Waals interactions相互形成鍵結，讓比較hydrophilic的phosphate-sugar backbone朝向外頭去和水分子做interaction，這時候，那些本來比較order的水分子就又恢復了本來很free的狀態，不斷在彼此之間以及和DNA backbone短暫的形成氫鍵，於是order下降，entropy就上升了 (hydrophobic interaction) ，是以double helix才是在水中比較被favored的狀態。

總而言之，鹼基對之間的氫鍵其實在dsDNA的結構穩定性上，只是扮演minor contributor的角色，它們真正重要的原因，還是在它們賦予了鹼基配對的specificity，這個specificity在DNA的replication與transcription上，都扮演了非常重要的角色，換句話說，鹼基對之間的氫鍵真正的重要性，並不是存在於維持double helix的穩定性上，而是在它們的biological meanings上。