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2010年8月24日 星期二

Ethanol precipitation

Ethanol precipitation是在wet lab裡頭常常用來將DNA從水中給precipitate下來的方法。
在做ethanol precipitation時很重要的一點是在溶液中必須加入cation,這樣才能順利的將DNA給precipitate下來。最近格主忽然發現有許多人並不道這點,或著是知道要加入cation,但卻不明白為什麼,也不知道到底ethanol為什麼可以precipitate DNA,只是照著實驗室學長姊的指導,把這個準則給背下來。
其實這個原理滿好懂的,只要有一點高中化學的基礎,就可以完全理解這件事。以下我就簡單的說明一下。
要知道DNA之所以會溶於水是因為它朝向外頭的backbone帶有負電,所以水分子會和它形成氫鍵,在DNA molecules的周圍形成類似hydrating shell的結構,於是DNA就會被這一堆圍繞著它的水分子給分隔開來,慢慢的均勻散佈在水中,這時,DNA就被水給”dissolve”了。
而如果我們能夠把這個負電給中和掉,很顯然水就無法和DNA形成氫鍵,自然也就無法dissolve DNA。同時,我們加進去的ethanol因為也可以和水形成氫鍵,於是我們可以用它來和DNA搶水,把水從DNA的周圍給”移走”,於是我們就能把DNA給precipitate下來。是以加入cation的目的就很明顯了-我們希望cation能夠和DNA形成ionic bonds,將DNA帶有的負電給neutralized掉。
但事情沒這麼簡單。想想看像NaCl這類的鹽類進入水中會發生什麼事?
很顯然它會dissolve在水裡變成Na+和Cl-,而不會像平常那樣形成非常穩定的crystal。這是因為水有很高的dielectric constant,根據Coulomb’s law
[F = (Q1 * Q2)/(e * r2),F是electrostatic force,e代表dielectric constant, Q1和Q2和代表兩個離子的電荷,r是兩個離子間的距離]
我們可以知道,當e很高的時候,F是很小的,所以兩個具有相反電荷的離子在這種情況底下並不會形成ionic bonds進而變成crystal,反而會被水分開,分別與水形成氫鍵。換個方式說,水會在它們外頭分別形成所謂的hydrating shell,將它們給隔開,讓他們均勻的溶在水中。
同樣的道理當然也適用於帶負電的DNA和我們加進去的cation。所以在沒有ethanol的情況底下,DNA和cation是不會形成ionic bonds的。
可是當ethanol被加進水中,dielectric constant比較低的ethanol會降低現在這個solution overall的dielectric constant,於是F就增加了,這個時候,DNA和cation才能形成ionic bonds,把電性neutralize掉,變成crystal被precipitate下來。
除此之外,cation還有其他的功用:它可以stabilize DNA的double helix結構。
第一眼看到這個說法似乎很怪,cation顯然會干擾DNA的鹼基對形成氫鍵,照這樣的邏輯去推論,cation應該是會”destabilize” DNA才對。
會有這個想法大概都是受到平常做實驗,特別是在設計primer或著做PCR時,計算GC content提到GC%的高低會影響DNA的melting temperature (Tm,指有一半的DNA molecules被denature成為單股時的溫度,最簡單的算法: Tm= [4(G+C)+2(A+T)]℃) ,於是留下了hydrogen bonds是影響DNA stability的主因的印象。
不過實際上兩股DNA的鹼基配對所形成的氫鍵對於DNA整體的stability幫助不大 (請注意,是幫助不大,不是沒有幫助。譬如說GC配對對於DNA stability的貢獻就比AT配對要來得大,因為GC可以形成三個hydrogen bonds,但AT只能形成兩個。當然GC能夠contribute to double helix的stability還有他的base stacking effect是比較被favored的) ,它們扮演的角色主要還是在使得DNA相互配對的鹼基具有specificity上。
鹼基對之間的hydrogen bonds之所以對DNA overall的stability影響不大是因為DNA是溶在「水中」的,那些在AT與GC鹼基之間形成的氫鍵,也可以和水分子形成hydrogen bonds,而且它們之間形成的hydrogen bonds並不會比它們以單股形式存在時和水分子形成的hydrogen bonds強,而這些鹼基間的氫鍵,必須比單股形式的DNA鹼基與水分子之間形成的氫鍵要強,它們才能stabilized DNA。
那到底是什麼原因導致DNA在水中會spontaneously形成double helix的結構?
答案很簡單,double helix結構的stability還是由free energy (△G) 的改變來決定。大家應該都知道△G與entropy和enthalpy有關:
[△G=△H-T△S,△H是enthalpy的改變量,△S是entropy的改變量,T則是絕對溫度,△G是負的時候,反應會傾向spontaneous發生]
在這裡,enthalpy只扮演微乎其微的角色,因為在dissolve DNA時被interfered的hydrogen bonds會被DNA backbone與水分子形成的hydrogen bonds給compensate,所以我們可以不考慮它的影響。
至於entropy,由於DNA的鹼基是比較hydrophobic的結構,所以當這些鹼基expose在水中,水分子會在它們的周圍排列成比較order的結構,這些水分子之間的interactions也比一般的水分子來得強,於是entropy就降低了,是以single strand的DNA在水中是比較不被favored的結構。
反之,當兩條DNA彼此纏繞形成double helix時,這些鹼基會被pack在中間,兩股DNA彼此complementary的base之間會形成氫鍵,此外,同一股上相鄰的鹼基彼此也會以Van Der Waals interactions相互形成鍵結,讓比較hydrophilic的phosphate-sugar backbone朝向外頭去和水分子做interaction,這時候,那些本來比較order的水分子就又恢復了本來很free的狀態,不斷在彼此之間以及和DNA backbone短暫的形成氫鍵,於是order下降,entropy就上升了 (hydrophobic interaction) ,是以double helix才是在水中比較被favored的狀態。
總而言之,鹼基對之間的氫鍵其實在dsDNA的結構穩定性上,只是扮演minor contributor的角色,它們真正重要的原因,還是在它們賦予了鹼基配對的specificity,這個specificity在DNA的replication與transcription上,都扮演了非常重要的角色,換句話說,鹼基對之間的氫鍵真正的重要性,並不是存在於維持double helix的穩定性上,而是在它們的biological meanings上。

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