The synthesized cell?

Creation of a Bacteria Cell Controlled by a Chemically Synthesized Genome這篇文章應該算是最近刊載在Science上最紅的一篇文章，甚至可以說最近生物學界最有話題性的文章。

這個由J. Craig Venter Institute的J. Craig Venter主導的計畫花了超過15年和4千萬美金，成功的在實驗室裡將database中digitalized的genome sequence information轉換真實世界裡的genome sequence，合成出第一個完整的人造genome，並成功的把這個genome放進了所謂的recipient cell裡，且這個recipient cell不只活得很好，還可以不斷複製自己的後代。也就是說他們成功的讓一個被人工合成的genome控制的生命可以自行在實驗室繁衍。

(Craig Venter在J. Craig Venter Institute? 別懷疑，我沒寫錯。J. Craig Venter是一個美國的生物學家，他自己創立了一個以自己名字命名的Institute，非常有趣。)

這是一個很有影響力的研究，即使在突飛猛進的biotechnology領域中也算是一個大躍進等級的突破，值得我們拿出來好好討論。關於技術細節的東西我在這裡不會探討太多，那太無聊了，不過我會稍微解釋一下他的實驗流程和一些principles，然後寫一些我自己對於這個研究的看法。雖然不保證可以做得到，但我希望我可以讓它看起來有趣一點，而且可以讓有一些生物基礎的人都看得懂。

首先，讓我們從選材開始講起吧。作者的目的是要製作一個由人工合成的genome所控制的細胞，那麼他第一個要面對的問題就是『要選取哪一種生物的genome來當做合成的目標?』

由於這是人類第一次嘗試合成整個genome，然後把這個genome放進細胞中，讓這個genome控制細胞的所有功能，選擇一個最簡單、最好合成、最好操作的genome來做這個實驗應該是非常合理的。

那麼，什麼是最簡單、最好合成、最好操作的genome呢?

當然就是最小的genome。而目前我們所知道擁有最小的genome，而且可以在lab裡頭培養的細胞，是一種叫做黴漿菌(mycoplasma)的生物，他的genome大小大概在58萬個base pairs左右(580kb)。

這生物神奇得很，雖然是屬於原核生物(prokaryotes)的一種，但不具有細胞壁，而且會寄生在別的細胞裡頭。由於mycoplasma是prokaryotes，所以他沒有細胞核，這樣作者在合成完他的genome，要把這個genome放入recipient cell中時就只要處理如何把genome放入細胞膜內，而不用考慮到如何讓genome通過細胞核這個問題，這樣技術上的困難度就比較低。因為這些優點，所以作者就決定選擇以mycoplasma的genome來當做合成的目標。

當然，mycoplasma也有很多種，而且即使是同一種的mycoplasma，在不同的database中的genome sequence可能也會有一點點不同，除此之外還要考慮到polymorphism的問題。Anyway，作者想了些辦法解決這些問題，並選了Mycoplasma mycoides subspecies capri這個種(species)來當做是genome donor。他們在網路上的database中找到了這個亞種的genome sequence，然後開始把這些digital information轉換成生命共通的語言，也就是ATGC這四個nucleotides組成的DNA sequence。(其實擁有最小genome的mycoplasma是Mycoplasma genitalium，不過因為生長速度很慢，所以作者沒有選擇他。)

看到這裡，也許你會想問:「為什麼最小的genome就是最簡單、最好合成、最好操作的genome呢?」

這有幾個理由。首先，我們目前化學方法人工合成DNA的能力有限。隨著想要合成的DNA長度增長(也就是說要組成polymer的nucleotides愈多，或著說是polymer愈大)，合成的效率也會跟著下降。

在這裡我嘗試用一個很簡單的類比讓大家理解這樣的事情。

假設我們每加入一個特定的nucleotide到已經存在的DNA sequence上的準確率(fidelity)是99.999%，那麼我們要合成由ATGC四個nucleotides所構成的DNA sequence的準確率就是99.999³%，也就是99.997%，依舊是非常好的準確率。但如果我們要合成的是一個由多達10k個nucleotides所組成的DNA sequence呢?那麼我們的準確率就是會只剩下99.999^10K%，這是一個非常非常差的準確率。所以我們首要就是不能選擇一個超出我們合成能力之外的genome。很不幸的，即使是目前已知最小細胞的genome，可能也還是超出我們的化學合成能力之外。我去查了一下和J. Craig Venter合作的BlueHeron Biotechnology公司，他們的網頁寫他們可以合成的DNA長度可以超過50kb，這的確很長，比我自己印象中可以準確合成的長度還要長上不少(生物科技果然是日新月異阿！)，不過即使是目前已知的最小genome，也還比這要大上10倍，所以要直接合成整個genome，依現在的科技可能還是力有未逮。

在這種情況底下，要製造出一個生物的genome，可能就要先合成一小段一小段的DNA sequence，然後再把這些sequence給接起來。一般我們要把DNA sequence接起來，最簡單的方法就是用restriction enzyme(restriction endonuclease or RE)去切DNA sequence，之後再用ligase去把sequence給接起來，也就是我們俗稱的cut and paste，但這樣的方式在連接比較大的DNA片段時效率很差，可能也會有設計上的困難，所以在這邊作者主要使用的是一種叫做in vivo homologous recombination的方式，在yeast(Saccharomyces cerevisiae)中把這些片段給連接起來。要解釋in vivo homologous recombination太麻煩了，要講一些比較分生和mechanism的東西，這裡就擱下不談，只要知道他是一種可以把較大的DNA片段給接起來的技術就好。

作者這裡用的策略是先用化學方法合成大小大概是1000bp(base pairs)左右的DNA片段，然後把這些片段每十個一組在yeast裡用recombination的方式組合起來，拿到很多10kb左右的片段，再把10kb的片段每十個一組recombine起來，拿到11個100kb的片段，最後再把這些片段給recombine成一個完整的genome。

從上面的過程我們可以了解為什麼愈小的genome愈好操作的另一個理由:每一次recombination成功拿到想要的assembly的機會都是有限的，而愈長的genome要recombine的次數就愈多，也就愈難得到想要的assembly，況且每次做完assemble的動作之後，也都需要去做一些實驗verify得到的products到底是不是帶有正確的sequence，是以genome愈大會耗時會愈久。作者做這個最小的genome就花了15年，如果他選擇了大一點的genome，可能做到往生也做不出來，在需要搶第一的科學界，這當然是大忌。

當作者成功的合成出這個genome之後，接下來就是要把這個genome給放進一個recipient cell裡頭，讓他取代原本的genome，然後看看這個synthesized genome可不可以成功的讓這個cell活下去，甚至繁衍後代。在這裡，作者很有技巧的選擇了一個不是Mycoplasma mycoides subspecies capri(M.mycoides)，但在演化上的關係與M.mycoides非常相近的細胞Mycoplasma capricolum subspecies capricolum(M.capricolum)當做是recipient cell。這個選擇技巧的地方在於當作者把synthesized genome放到recipient cell裡頭取代原有的genome之後，這個recipient cell其實還會帶有原本的genome合成出來的很多protein和RNA，也就是說他還會繼續具有原本genome的特色。但是當這些protein和RNA慢慢turnover掉，synthesized genome所做出來的protein和RNA就會開始讓這個cell變得比較像是M.mycoides而非M.capricolum，這樣就可以用來確定這個synthesized genome是真的有take over recipient cell的生長、複製、metabolism等過程。

處理完選擇recipient cell的問題，接著作者就要解決該怎麼把synthesized genome給放到recipient cell裡頭去這個問題。

要把外來的gene或著DNA片段放入prokaryotic cell中的最簡單方法就是利用heat shock來做transformation，把DNA transform進competent cell中。此外，現在還有一些非常先進的kit，甚至可以不用heat shock，就直接把想要放進competent cell的DNA片段給transform到原核細胞裡頭。而如果要把DNA片段放進eukaryotic cell中，那就困難多了。Calcium phosphate transfection; viral infection; electroporation和利用liposome把DNA片段送入細胞裡頭是比較常見的做法。

但是這些方法都有其限制。一般來說，當我們想要把已經合成好的DNA片段放入細胞中時，也是愈大的DNA片段愈難操作。譬如說我們今天想要把一個4k的plasmid transform到到E.coli裡頭，這基本上是非常容易的事情，但如果是一個10k的vector，transform的效率就會降低許多。而在這裡，作者想要送入細胞的，可不僅是一個10k的vector而已，而是一個500k以上的genome，就我所知，在作者成功開發出可以把這麼大的genome放入prokaryotic cell的技術之前，還沒有人能夠成功的把這麼大的DNA片段放入細胞中，成功達成whole genome的transplantation。

在2009年的時候，J. Craig Venter團隊成功的研發出可以把whole bacterial genome給transplant到另一個bacteria的技術。如同這篇刊載於Science，名為Genome Transplantation in Bacteria: Changing One Species to Another的文章裡的描述，作者們成功的發展出polyethylene glycol–mediated transformation這個技術(一樣，我們不去處理這個技術的細節。況且這篇paper雖然很酷，格主在看到標題，想到它的impaction時，整個人眼睛放光，但paper的內容實在很無聊，令格主在讀的時候有好幾次都差點睡著)，讓他們可以把完整的M.mycoides genome給放入M.capricolum裡頭，並取代原本屬於M.capricolum的genome。

這裡要特別提出來的是，作者在這裡只是成功的把幾乎是純的、protein-free的whole genome DNA sequence給transplant到另一個細胞裡，並不是真的把一個bacteria的chromosome給放進另一個bacteria裡頭。是以，作者在把synthesized genome給放進recipient cell裡頭時也必須把幾乎是protein-free的DNA好好的給純化出來，否則這個transformation的技術很可能不會work。特別是前面提到作者在組裝genome的時候，是在yeast裡頭弄的，而他們現在必須把genome給放到bacteria裡頭，那麼他們不但必須有很好的技術可以把synthesized genome給extract出來，得到很純的DNA，還必須能夠把yeast的DNA和synthesized DNA給分開才行。

同時，在這邊我們又可以找到一個genome size愈小愈好的理由。在prokaryotic的世界裡，C-value(就是genome的大小，通常以haploid genome的base pairs數來表示)愈小通常代表生物的複雜度愈低(這是唯一違背C-value paradox的例外)，也就是說，genome size愈小的prokaryotes愈不複雜。而通常，愈不複雜的生物在manipulation上就愈容易。是以我們可以預期擁有最小genome的microplasma是相對簡單的生物，要利用它開發一個新的transformation技術，應該也是比較簡單的。因為當我們把synthesized genome放入細胞中時只能選擇與donor cell在演化上相近的cell當做recipient cell，這樣這個genome的訊息才能夠被順利的讀出來(演化上相距太遠的物種可能沒有可以讀這個synthesized genome的 transcription factors)，是以如果我們一開始就選太複雜的genome來合成，這個recipient cell也必須是比較複雜的生物。譬如作者選了eukaryotic cell的genome來合成，那recipient cell就必須是類似的eukaryote，此時transplantation就必須解決讓genome進入nucleus的問題，又或著作者選了E.coli的genome來合成，那也許transplantation時就會受到cell wall的影響，所以在初次嘗試以synthesized genome控制細胞時，最小的genome應該是最好的選擇。

最後，在克服了許多困難之後，作者成功的讓synthesized genome take over整個細胞的生長與功能，而且發現個細胞可以成功的自我複製，產生下一代。換句話說，他們成功的利用digital information創造了一個生命的blueprint。而作者自己則說，他認為他們創造出了一個“synthetic cell”，他們對於這個細胞的闡述如下:

“We refer to such a cell controlled by a genome assembled from chemically synthesized pieces of DNA as a ‘synthetic cell’, even though the cytoplasm of the recipient cell is not synthetic.”

這段話本身沒有什麼問題，處理得相當精確，特別是他強調他們並沒有合成出一個細胞中除了genome以外的任何東西。不過既然作者自己都承認〝the cytoplasm of the recipient cell is not synthetic〞，我認為把這個細胞稱為是synthetic cell並不恰當，有點misleading，甚至有些言過其實的意味。

DNA本身其實並不是生命。單獨存在的DNA只是一個非常穩定的聚合物，不但與生命搭不上邊，甚至沒有什麼太多的用處。唯有當DNA被lipid bilayer給包圍起來，配合上其他形成生命所不能或缺的分子，才能夠讓「生命」真正的開始「運作」。站在分子生物學的角度來看，DNA其實比較像是生命的藍圖，他的sequence記載了所有執行生命功能所需要的訊息在裡頭。但就好像一個世界一流的設計師畫出了一棟房子的設計藍圖，並不代表他就能夠建起這棟房子，我們能夠合成生命的藍圖也不代表我們就能夠合成生命，即使是最簡單的生命形式也一樣。

DNA是儲存生命訊息的分子。他能夠被精確複製的特性讓我們能夠不斷繁衍類似的下一代，也因為它的sequence撰寫著生命的訊息(注意，是DNA的sequence，而不是DNA本身)，所以當我們能夠合成特定的DNA序列，我們就能夠撰寫生命的藍圖，但這不代表我們能夠讓DNA sequence變成生命，而是我們必須讓DNA sequence所儲存的訊息被解讀出來，這樣構成生命的功能才有可能被執行。如果沒有原本就存在細胞質中的transcription factors，沒有可以合成protein的ribosomes和tRNA，細胞根本讀不出來synthesized genome裡面的資訊，生命也就無法被完成。所以你可以看到作者選擇的recipient cell是與M.mycoides在演化上十分相近物種，因為相隔太遠的物種很可能沒有解讀這個genome所需要的transcription factors，如此一來這個synthesized genome就無法被解讀。所以，作者其實只是證明了他可以合成有效的生命藍圖，或著說是成功寫出生命的程式碼，但要讓這個程式碼被解讀，我們還需要其他的電腦硬體搭配，在我們能成功做出這些硬體前，我們都不能說我們做出了一台電腦。是以，作者雖然成功的做出了可以在放入細胞後讓生命開與運轉的DNA sequence，我們離要合成生命或細胞還是有很長很長的一段路要走。

即便如此，這篇paper依舊是對biotechnology有非常巨大的貢獻。他暗示了一個很重要的可能性---也許以後我們可以先嘗試著用電腦撰寫生命的程式碼，然後以化學方法將這些digitalized的程式碼變成DNA sequence，最後拿到一個我們想要但在自然中沒有的生物。這個生物可以帶有我們要的特性，例如當成一個很好的model system，或著具備我們想要的多種特質，好比同時可以大量的吸收環境中的污染物，然後又帶有能夠將污染物代謝成為能源的能力。

當然，要達成這個目標，我們必須做到cost down和加速兩件事情，這樣這個技術才會有應用的價值。作者自己對這點是很樂觀的，他不斷提出sequencing的技術當做例子，剛開始的時候它也是又貴又耗工，但後來變得愈來愈便宜，愈來愈快速。重點是它演進的速度非常非常快，從1970年代末期Frederick Sanger和Walter Gilbert各自發展出sequencing的方法之後，到了1990年human genome project開始進行，當時花了天文數字的美金，需要跨國團隊的合作，花了13年才完成，之後我們的sequencing技術突飛猛進，到了2010年，sequencing的價錢、準確度與速度都已經變得非常可親。

但我自己是覺得我們還有很長的路要走。首先，自己設計生命的藍圖跟按照原有的生命藍圖合成DNA sequence在難度上有很大的差別(就好像自己創作一幅偉大的畫和臨摹一幅偉大的作品一樣，前者肯定要難上許多)，再者，我們更不能忘了，作者是撿了個genome size最小的軟式子來吃，而且還躲開了eukaryotic cell的複雜度更高，還具有nucleus的問題。因此我認為即使我們真的能夠成功的設計genome，我們依舊會被限制在prokaryotic cell的世界中很久。

不過不管怎麼說，這都是一個非常重大的breakthrough，對biotech有興趣，或想要撈一筆的人都可以密切留意之後的發展，發揮自己的想像力看看這個技術可以用在哪些地方，甚至自己動手開始進行cost down與加速的動作。在不理會道德問題的情況下，這個技術所帶來的前/錢景，光用想的就讓人興奮萬分！